◇◇新语丝(www.xys.org)(xys.dxiong.com)(xys.3322.org)(xys.xlogit.com)◇◇   新泰克公司关于丘小庆“造假事件”内部文件公开(一)   关于西藏药业质疑抗菌多肽(PH-SA)的药效与链霉素有关的过程   2003年9月底,新泰克控股公司的关联公司――成都阳辉生物科技有限公司 与西藏华西药业有限公司签订了“重组PH-SA临床前药学研究协议”。   2003年10月28日,西藏华西药业集团有限公司研究所的所长来电告知, PH-SA的杀菌作用可能是由硫酸链霉素引起的。因为,使用丘小庆教授提供的菌 种,按生物制品的常规工艺流程制备的多肽始终不能再现PH-SA的抗菌活性。且 丘小庆教授实验室制备的样品(030627批)硫酸链霉素的残留量高达4.686mg/ml。   2003年10月30日,公司负责人委托四川大学华西医学院移植免疫实验室的技 术员张杰,在公司负责人和左俊勇的陪同下到广汉与西藏华西药业有限公司研究 所所长,就链霉素问题进行了交流。所长提供了一份关于对PH-SA的链霉素残留 量的测定报告。张杰看完报告后,当时没有发表任何看法。公司负责人对所长说, 我们先将报告带回去,与发明人丘小庆讨论后再给你们回话。   2003年11月05日,公司安排西藏药业两位负责人来到靶向抗菌多肽联合实验 室与丘小庆就链霉素问题进行了交流。在不到10分钟的会谈过程,双方就情绪激 动地争辩起来,各执己见,左俊勇将两位负责人劝离了实验室的时候,丘小庆激 动地对他们说:“我做蛋白质研究的时候,你们都还没有生出来”。最后不欢而 散。   2003年11月07日,公司负责人对发明人丘小庆表示,你既然不认同西藏药业 的说法。对这种学术问题,你必须拿出试验数据去证明他们的说法不成立。否则, 别人始终都可能会有说法的。   2003年11月07日――11月10日,丘小庆、张杰在移植免疫实验室,用分光光 度仪器检测了最近抗菌多肽联合实验室制备的PH-SA的链霉素残留量。据丘小庆 在测试过程中表示,链霉素含量相当低,根本就不是西藏药业所说那么高(在场 人员还有左俊勇、移植免疫实验室的研究生曾林雨【音】和另外不知名的两位)。 期间,丘小庆将西藏药业对PH-SA的意见告诉了来到实验室的华西医院副院长程 惊秋。程惊秋对此未作任何表态和反应,随后就离开了。   2003年11月10日,丘小庆得出的对PH-SA链霉素残留量的测定结果,并给西 藏药业发出了“关于抗菌多肽的效力是否是沉淀DNA所残留链霉素所致的回答” 的函。   附:   关于抗菌多肽的效力是否是沉淀DNA所残留链霉素所致的回答   1、 浓度   贵公司分光光度法测定显示我们制备的抗菌多肽中残留链霉素浓度为 4.686mg/ml,而该制备中抗菌多肽含量为1mg/ml左右。   4.686/600(链霉素分子量)=7.8 x 10-3mM   1/70,000(抗菌多肽分子量)=1.4 x 10-5mM   如果贵公司测算的残留链霉素分子全部与抗菌多肽分子结合,无法被透析手 段清除的话,那么在这个浓度下,每一个抗菌多肽分子就结合至少一百个链霉素 分子。无论用非特异结合还是用特异结合来解释,这都是不可能的。再者,如果 链霉素分子与抗菌多肽分子是按这个数量关系结合的话,这样的复合物早就沉淀 了,因为这是在制备抗菌多肽过程中加入链霉素的本意:利用链霉素的这个特性 来沉淀我们不需要的东西。   即使降低上述链霉素浓度十倍,为0.4686 mg/ml,其毫克分子量仍比抗菌多 肽毫克分子量大一个数量级,十倍。在这个浓度下,每一个抗菌多肽分子仍结合 了至少十个链霉素分子。这样的复合物仍会沉淀,再者,无论用非特异结合还是 用特异结合来解释,这都是不可能的。   因此,任何一个稍微具备一点stoichemistry(化学计量学)起码知识的科 学工作者都会发现,以上述比例存在的链霉素-抗菌多肽复合物是必定要沉淀的。   2、 对制备抗菌多肽过程中残留链霉素浓度的推算   高速离心的上清液约300ml,加入链霉素3gm后(合每毫升上清液含10mg链霉 素,也就是说,经我们制备处理后,抗菌多肽中液中仍残留了)经搅拌混均变为 白色混浊液体,10,000-30,000g,10min离心后析出与加入的链霉素粉剂体积相 仿的沉淀,我们假设已有80%的链霉素随复合物析出,   3gmx0.2=0.6gm=600mg   那么在300ml上清液中还残留600mg链霉素。让我们随贵公司的思路,由于这 些链霉素都已与蛋白结合,在透析处理过程中没有丢失,但在透析处理过程中透 析袋中出现大量的沉淀,再次10,000-30,000g,10min离心后析出沉淀,我们假 设再有50%的链霉素随复合物析出,   600×0.5=300mg   那么在300ml上清液中还残留300mg链霉素。上样过柱,绝大部分蛋白都被穿 柱洗脱,挂在柱上的抗菌多肽分子量后被0.2M NaCL洗脱,这一部分蛋白量只相 当于穿柱洗脱蛋白量的1/50,那么,   300mg/50=6mg   也就是说,0.2M NaCL洗脱的蛋白溶液30ml中有6mg残留链霉素,那么,   6mg/30=0.2mg/ml   也就是说,我们制备的抗菌多肽溶液中每毫升最多只含有0.2mg残留链霉素, 比贵公司分光光度法测定的4.686mg/ml低23.43倍!   请注意,就是这0.2mg/ml也是大大高估了的残留量,因为,   1、 在沉淀处理中,至少有50%的链霉素与DNA结合而沉淀了。   2、 在透析处理中,大量的分子量小于15,000-20,000的链霉素-DNA和链霉 素-蛋白复合物被透析掉了。   3、 加入的链霉素量是过饱和量,大量游离的,可被透析的链霉素分子必需 从加入的三克总量中扣除。   4、 每一个抗菌多肽分子都有一个半胱氨酸,在贵公司加热,加硷,加酸的 处理过程中,其SH基因必然游离出来并可能与三氯化铁反应。   最后,该制备过程发表在1967年的Journal Bactcriology上,四十年来,全 世界成百上千的科学家都在使用该方法制备蛋白,如果制备中含有这样大量的链 霉素的话,该制备过程早就被淘汰了。   远的不说,我在Dr.Finkelstein实验室工作期间,一直随Dr.Jakes(此人自 1973年至今一直从事大肠菌素分子生物学研究,其老师是分子生物学奠基人, Dr.Norton Zinder,Rockefeller大学校长,该制备过程即由Dr.Jakes自Zinder实 验室带入Dr. Finkelstein实验室的)用该制备过程提取大肠菌素并用提取的大 肠菌素经平板法测定其杀大肠杆菌效力。野生型大肠菌素可以杀灭大肠杆菌,而 突变大肠菌素却不能。如果遵循贵公司的推论,那么野生型大肠菌素和突变大肠 菌素制备都应杀菌,因为这两种制备中都应该含有同样剂量的残留链霉素!   川抗所的抗菌多肽药效测定报告展示的抗菌谱与链霉素抗菌谱完全不同。   3、 使用贵公司分光光度法测定的链霉素浓度杀菌结果   取BM液体培养基和耐甲氧西林金葡菌BAA-42行抑菌试验三次,每次延续六 至八小时。   另按贵公司猜想设置如下试验,取杨总带回,贵公司制备的抗菌多肽200μl 与上述两种剂量链霉素孵育30分钟加入10ml培养基。   以我们制备的抗菌多肽200μl加入10ml培养基作为对照。   试验图:   上述试验结果清晰的显示我们制备的抗菌多肽的抑菌活性远远强于贵公司所 测定剂量链霉素的抑菌活性,而贵公司制备的蛋白无抑菌活性。   11月16日发表的Nature Biotechnology文章中描述了我们的抗菌多肽制备过 程。我不理解为何贵公司要怀疑全世界认可的,已使用了数十年的链霉素沉淀 DNA制备过程。更不理解为何要使用如此不精确的“链霉素测定方法”来作为依 据去怀疑这种制备过程。需知全世界上百个制药公司的实验室每天都在重复上万 乃至十数万次的抗菌素抑菌实验。如果链霉素能够杀灭耐甲氧西林金葡菌的话, 人们为什么还要花费上百亿的美金和数十年的功夫去发展新抗生素呢?   我所在的纽约实验室,是人类对大肠菌素的离子通道功能和结构了解得最透 彻的实验室,以我们对该通道得结构和功能得理解出发,无从想象链霉素是如何 与大肠菌素发挥协同作用得。请注意,两性霉素等作用于细胞膜上的抗菌素是我 老板Dr.Alan Finkelstein 于70年代在这个实验室发展成功的。   因此,我只能遗憾的告知贵公司,你们的分光光度法测定报告 does not make any sense.   此致   敬礼!   四川大学华西医院移植免疫室   丘小庆上   2003年11月10日 (XYS20060118) ◇◇新语丝(www.xys.org)(xys.dxiong.com)(xys.3322.org)(xys.xlogit.com)◇◇