◇◇新语丝(www.xys.org)(xys2.dxiong.com)(www.xysforum.org)(xys-reader.org)◇◇   致四川农业大学博士生导师程安春教授的公开信(完整版)   我是中国农业大学动物医学院张大丙,针对四川农业大学博士生导师程安春 教授及其合作者发表的两篇文章(下列“文章一”和“文章二”)我提出六个问题, 分别是:“文章二”中用了我们的研究结果为何不引用我们的文献、“文章二” 为何对被引参考文献作者改名换姓、错误的翻译我国省(市、自治区)名是何道理、 是否涉嫌重复发表、是否涉嫌学术造假和是否涉嫌利用审稿之机霸占我指导的本 科生的研究成果。为方便描述,程安春教授及其合作者发表于《中国兽医科学》 的文章称为“文章一”,程安春教授及其合作者发表于《Journal of Microbiological Methods》的英文称为“文章二”。因两篇文章的通讯作者相 同,为方便描述,材料中涉及到这两篇文章的作者时均简称为“作者”。材料中 还涉及到“文章三”,因其通讯作者也相同,故涉及到其作者时也简称为“作 者”。   “文章一”:程安春, 汪铭书, 信洪一, 陈海军, 杨苗, 郭宇飞, 朱德康, 贾仁勇, 袁桂萍, 陈孝跃Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立. 中国兽 医科学, 2007, 37 (01): 38-42.   “文章二”:Cheng Anchun, Wang Mingshu, Xin Hongyi, Zhu Dekang, Li Xinran, Chen Haijuen, Jia Renyong, Yang Miao. Development and application of a reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect Chinese isolates of duck hepatitis virus type 1. Journal of Microbiological Methods (2008), doi: 10.1016/j.mimet.2008.07.018.   “文章三”:Miao Yang, Anchun Cheng, MingshuWanga, Hongyi Xinga. 2008. Development and application of a one-step real-time Taqman RT-PCR assay for detection of Duck hepatitis virus type 1. Journal of Virological Methods 153, 55–60.   一、“文章二”中用了我们的研究结果为何不引用我们的文献?   “文章二”描述的是检测血清1型鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus 1, DHV-1)的RT-PCR方法的建立与应用。在该文的讨论部分,“作者”写道: “Based on the data analyzed from the 3D gene sequences (GenBank accession numbers: EF064886, EU106104, EF064886, DQ864514, and DQ864515), we established a specific RT-PCR assay for the detection of DHV-1.” 这句话表明,这5条3D序列对于该RT-PCR的建立是至关重要的,然而, “作者”没有引用与之相关的已发表的3篇文章中的任何一篇作为参考文献!   注:5条3D序列应为4条,程安春教授及其合作者提交的EF064886和EF064886 相同,属重复列出,除这条序列没有文献可供参考外,其余3条序列(EU106104, DQ864514, DQ864515)均是我及我的合作者所测定的,分别有与之相关的文章:   (1) 与序列DQ864514有关的文章: Ding, C., Zhang, D., 2007. Molecular analysis of duck hepatitis virus 1. Virology 361, 9–17 .   (2) 与序列DQ864515有关的文章: 丁春宇, 张大丙. 鸭肝炎病毒基因组3’ 末端序列的克隆和分析. 病毒学报, 2007, 23(4):312–319.   (3) 与序列EU106104有关的文章: Wang, L., Pan, M., Fu, Y. and Zhang, D. 2008, Classification of duck hepatitis virus into three genotypes based on molecular evolutionary analysis. Virus Genes 37, 52–59.   二、“文章二”为何对被引参考文献作者改名换姓?   “文章二”的文献部分以及“文章二”中引用下述文献的对应部分,共有5 篇被引文献中的15个作者被“文章二”的“作者”改名改姓,其模式是以第一个 名字为姓,将第二个名字和/或姓作为名字。这5篇文献分别是:   (1) Changsun, C., Seung, K.H., Chanhee, C., 2004. Development of nested RT-PCR for the detection of swine hepatitis Evirus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues and comparison with in situ hybridization. J. Virol. Methods 115, 67–71.   (2) Chun, H.T., Nick, J.K., Hsiang, J.T., 2007. Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 indicates that it should be assigned to a new genus. Virus Res. 123, 190–203.   (3) Dongyou, L., Mark, L.L., Frank,W.A., 2004a. Specific PCR identification of Pasteurella multocida based on putative transcriptional regulator genes. J. Virol. Methods 58, 263–267.   (4) Dongyou, L., Mark, L.L., Frank, W.A., 2004b. Specific PCR identification of Pasteurella multocida based on putative transcriptional regulator genes. J. Microbiol. Methods 58, 263–267.   (5) Dieter, V., Freddy, H., Katleen, H., 2007. Multiplex PCR assay for the detection of high   virulence rabbit Staphylococcus aureus strains. Vet. Microbiol. 121, 368–372.   为证实这一点,可与上述文献的作者真实姓名进行比较。2004年的J. Virol. Methods没有58卷,因此无法检索到文献(3),它可能就是文献(4),如果是这样 的话,文献(3)和(4)为重复引用。这样,共有4篇被引文献中的12个作者被“文 章二”的“作者”改名改姓。其中文献(2)在进入In press阶段若干天后被 《Journal of Microbiological Methods》删除。由于“文章二”已进入In press阶段,它不会是“作者”修改的结果,应当是被引文献作者Hsiang-Jung Tsai发现后抗议的结果。   三、错误的翻译我国省(市、自治区)名是何道理?   “文章二”中,“作者”将我国的北京市、重庆市和广西自治区分别翻译为 Beijing province, Chongqing province, Guangxi province,将我国的吉林省、 云南省和贵州省分别翻译为Jieling province, Yuennan province, gueizhou province 。   程安春是四川农业大学的教授和博士生导师,承担了科技部、农业部、教育 部和四川省的多个重大项目(详见文章一和文章二)。从程安春教授获得教育部 “新世纪优秀人才支持计划”项目的资助,表明程安春教授是我国新世纪优秀人 才。从程安春教授获得四川省杰出青年学科带头人基金后续资助项目的资助,表 明程安春教授是四川省杰出青年学科带头人。从百度检索程安春教授的简历还得 知,程安春教授是四川省学术和技术带头人、中国畜牧兽医学会动物微生态学分 会理事长、中国畜牧兽医学会禽病学分会常务理事、《病毒学报》编委、《中国 兽医杂志》编委、中国新兽药评审委员会委员。如果不是亲眼所见,谁也不会相 信上述本属基本常识的问题会发生一个如此“优秀”的大学教授、博士生导师和 学科带头人身上,但它确实发生了!因程安春教授是“文章二”5个并列第一作 者之一和2个通讯作者之一,且作者实际排序第一,因此,不能将这些低级错误 的发生推到其他“作者”身上。我不禁要问:这是一个什么样的学术态度?是否 对得起国家几个部委和四川省科委所资助的那些重大项目?   四、是否涉嫌重复发表   “文章一”和“文章二”的内容均可分为两个部分,一是检测1型鸭肝炎病 毒(DHV-1或DHV Ⅰ)的RT-PCR方法的建立,二是该RT-PCR方法的应用。   该问题的提出首先源于“文章一”和“文章二”描述了一个完全相同的 RT-PCR方法的建立;再者,在RT-PCR方法的应用上,两篇文章的试验设计思路基 本相同;而“文章二”并没有引用“文章一”作为参考文献。   (一) 两篇文章中检测DHV-1 RT-PCR方法建立部分的比较   1.引物:“文章一”所用引物为FP(5′-ACAATGACCCAGCCTTAG-3′)和RP (5′ -CCACTGTATCTTCCCTTC-3);“文章二”所用引物为FP(5’ -acaatgacccagccttag-3’)和RP( 5’-ccactgtatcttcccttc-3)。   2. 扩增的靶基因:均为DHV-1基因组中440 bp的3D基因。   3 .RT-PCR条件和体系:相同,详见“文章一”1.5.1和“文章二”2.4。   4. 特异性检测:“文章一”提取下述对照的核酸进行试验,鸭瘟病毒、番 鸭细小病毒、鹅细小病毒、雏鹅新型病毒性肠炎病毒、禽流感病毒(H5N2亚型)、 鸭病毒性肿头出血症病毒、鸭源多杀性巴氏杆菌(5∶A)、鸭源肠炎沙门菌、鸭源 鼠伤寒沙门菌、鸭源致病性大肠杆菌(O78)、正常鸭胚尿囊液、健康鸭肝;“文 章二”以下述核酸进行试验,duck plague virus (DPV) DNA, muscovy parvovirus (MPV) DNA, avian influenza virus (AIV) RNA, Pasteurella multocida (PA) DNA, Riemerella anatipestifer (RA) DNA, Salmonella enteritidis (SE) DNA。   5. 敏感性检测:“文章一”中,将强毒株CHv-1的核酸进行系列稀释,取15 个稀释度用于检测,使每10 μl中分别含核酸3×1011–3×10-3 pg,敏感性结 果为30 pg;“文章二”中,将DHV的核酸进行系列稀释,取15个稀释度用于检测, 使每10 μl中分别含核酸3×1011–3×10-3 pg,敏感性结果为3 pg/10 μl。   (二) 两篇文章中检测DHV-1 RT-PCR方法应用部分的比较   在RT-PCR方法的应用部分,虽然“文章一”和“文章二”的写作风格有所不 同,所用样品的细节也有所不同,但经过比较,仍可见两篇文章设计了四个相同 的试验,第一个试验证实了所建立方法的可靠性,后三个试验得出了相同的结论, 即,RT-PCR的敏感性或检出率高于Dot-ELISA/ELISA和病毒分离。“文章一”中 使用的“临床送检的、并经病毒分离鉴定确诊为鸭肝炎的19份肝病料”用于两个 试验,既用于下述试验1,也用于下述试验3。   试验1、采用RT-PCR对19份DHV-1核酸进行检测   1.相同点: 结果相同,均可从19份DHV-1核酸中扩增出440-bp的3D基因,见 “文章一”的图3和“文章二”的Fig.1。   2.不同点   (1)样品不同:“文章一”为临床送检的、并经病毒分离鉴定确诊为鸭肝炎 的19份肝病料;“文章二”是从我国11个provinces分离的19个野外分离株 (field isolates)。   (2)样品获得时间不同:“文章一”样品来自1987年11月至2005年11月; “文章二”样品来自1985年至2006年。   (3)样品命名方式不同:(详见“文章一”的1.6.2和“文章二”的表1),请 注意有些名称的相似性。“文章一”的19份样品命名为CD871103、NC880302、 MY890203、LS900104、DY910405、QS920809、CQ930908、YA940701、CD950607、 NC960808、MY970903、LS980605、DY990302、QS001203、CQ011123、YA021011、 MY030519、LS040716、DY051106;“文章二”19株分离株命名为D1986、NC1988、 MY1989、LS1991、DY1990、QS1992、CQ1993、YA1994、GX1995、HB1996、 HLJ1997、YN1998、SC1999、HND2000、GD2001、HN2002、GZ2003、LS2004、 BJ2006。   试验2、采用RT-PCR、Dot-ELISA/ELISA和病毒分离三种方法对人工感染鸭的 组织进行比较检测   1.相同或相似点   (1)感染所用强毒株相同:均为CHv-1株。   (2)检测方法基本相同:均为病毒分离、ELISA和RT-PCR,不同之处是,“文 章一”采用dot-ELISA,“文章二”采用ELISA,按“作者”所引文献(Zhao et al,1991),应为间接ELISA。   (3)对肝脏的检测结果相同:“文章一”中,可从18只死亡鸭的肝脏中检测 到阳性结果(100%阳性率);“文章二”中,可从10只死亡鸭的肝脏中检测到阳性 结果(100%阳性率)。   2. 不同点   (1)试验用鸭的品种和数量不同:“文章一”用20只健康活泼的1日龄樱桃谷 鸭进行人工感染,10只作为空白对照;“文章二”用10只1日龄SPF Pekin duckling用于人工感染。   (2)鸭子死亡时间和死亡率不同:“文章一”中,10日龄时,鸭子死亡18只; “文章二”中,感染后,47-90 h全部死亡。   (3)检测组织不同:“文章一”中,取18只死亡鸭心、肝、脾、肺、脑用于 检测,正常对照也进行相关检测;“文章二”中,取10只死亡鸭肝脏用于检测。   试验3、采用RT-PCR、ELISA和病毒分离三种方法对保存样品进行比较检测   1.相同或相似点   (1)检测方法基本相同,均为病毒分离、ELISA和RT-PCR,不同之处是,“文 章一”采用dot-ELISA,“文章二”采用ELISA,此处未引文献,但根据上下文和 文后参考文献分析,疑为间接ELISA。   (2)保存温度相同:均为-20℃。   2.不同点   (1)样品不同:“文章一”为1987年11月至2005年11月临床送检的、并经病 毒分离鉴定确诊为鸭肝炎的19份肝病料;“文章二”为Twenty-two liver samples from ducklings infected with the DHV-1 CHv-1 strain between 1986 and 2006 (1 sample/year; stored at ?20 °C)。   (2)结果略有不同:“文章一”中,RT-PCR检出年限为18年,Dot-ELISA检出 年限为10年,病毒分离检出年限为6年;“文章二”中,RT-PCR检出年限为22年, ELISA检出年限为13年,病毒分离检出年限为11年。   试验4、采用RT-PCR、ELISA和病毒分离三种方法对临床样品进行比较检测   1.相同或相似点   (1) 检测方法基本相同:均为病毒分离、ELISA和RT-PCR,不同之处是,“文 章一”采用dot-ELISA,“文章二”采用ELISA,此处未引文献,但根据上下文和 文后参考文献分析,疑为间接ELISA.   (2)检测结果接近:“文章一”中,病毒分离阳性率为56.25%、Dot-ELISA阳 性率为75.00%、RT-PCR阳性率为91.70%;“文章二”中,病毒分离阳性率为 55.7%、ELISA阳性率为69.2%、RT-PCR阳性率为89.2%。   2.不同点:   (1)样品数量不同:“文章一”用48份;“文章二”用185份。   (2)样品说法不同:“文章一”描述为发病鸭临床症状和病理变化与鸭肝炎 相符;“文章二”描述为clinically suspected diseased liver samples of ducklings。   (3)样品采集时间不同:“文章一”中,结果和讨论部分均为2000~2005年, 而材料和方法部分说是1987~2005年;“文章二”中,表3显示为2006年1月14日 至2008年1月12日,而2.7(iii)部分标明为2006年5月至2008年1月。   (4)样品采集地区有所不同:“文章一”中,样品来自四川、重庆、贵州、 云南、广东、广西、北京、内蒙古和福建等18个省(市、自治区);“文章二”中, 样品来自Sichuan province、Chongqing province、Guangxi province、 Beijing province、Jiangxi province、Hunan、Anhui、Hebei province、 Jieling province、Helongjiang province、Yuennan province、Hainan province、Guangdong province、Henan province、Gueizhou province。   “文章二”的投稿日期是2008年2月29日,该文没有引用“文章一”作为参 考文献;然而,在2008年1月21日,“文章二”的8个作者中的4个将“文章三” 投到Journal of Virological Methods,该文引用了“文章一”作为参考文献。 综合考虑“文章二”和“文章三”的投稿日期、以及“文章二”和“文章三”与 “文章一”的相似程度,必须提出一个问题,“作者”是否已意识到“文章二” 涉嫌为“文章一”的重复发表,而之所以在“文章二”中不用“文章一”作为参 考文献,是为了刻意避免Journal of Microbiological Methods评审专家对重复 发表的注意?   五、是否涉嫌学术造假   (一) 关于引物及设计引物所用参考序列   “文章一”和“文章二”设计了名称(FP & RP)和序列均相同的引物,但 “作者”在两篇文章中宣称设计引物所依据的参考序列是不同的。   在“文章一”的前言部分,“作者”写道:“笔者所在实验室研究人员在构 建DHV Ⅰ基因文库的基础上,获得了DHV Ⅰ的CHv-1强毒株的全基因序列(另文报 道),其基因结构与小RNA 病毒科其他已知病毒基因结构非常相似。根据上述研 究成果,笔者在本研究中建立了检测DHV Ⅰ基因组的RT-PCR方法”;从材料和方 法部分可见“DHV Ⅰ的CHv-1强毒株3D蛋白基因序列”是引物设计的参考序列。   “文章一”的投稿时间是2006年9月21日,如果“作者”确实测定了CHv-1强 毒株的全基因序列,其测序完成时间应当在2006年9月21日之前。据此提出问题1。   问题1:两年过去了,与CHv-1全序列测定有关的文章“另文报道”在哪个刊 物?如果没有所谓“另文报道”的文章,“作者”在“文章一”中称已测定了 DHV-1强毒株CHv-1的全序列是否为了掩盖“作者”所用引物(FP和RP)序列的真实 来源(详见六、是否涉嫌剽窃)?   在“文章二”的材料和方法部分,“作者”称:设计引物所用的参考序列是 登录号为EF064886的序列。进入公共数据库可见,登录号为EF064886的序列实际 上就是分离株Sichuan株的440bp 3D序列,因引物FP和RP的序列位于该440bp 3D 序列的两端,因此,该440bp 3D序列颇似引物FP和RP的扩增产物序列。据此提出 问题2。   问题2:如果“作者”所在实验室确实测定了CHv-1强毒株的全基因序列,而 且“文章二”也使用了强毒株CHv-1,在“文章二”中设计引物时,为何不依据 CHv-1株的基因组序列反而依据一个长度与靶基因相同的序列(EF064886)?“文 章一”和“文章二”设计的是完全相同的引物,但“作者”却宣称依据的是不同 的参考序列,这是为何?“作者”是如何依据一个疑似为引物FP和RP的扩增产物 序列(EF064886)来设计引物FP和RP的?如果440 bp 3D基因序列(EF064886)不是 引物FP和RP的扩增产物序列,它是怎么得到的?   在“文章一”的讨论和小结部分,“作者”写道:“特异性的核苷酸序列是 建立PCR方法的基础,目前尚无DHV Ⅰ基因组核苷酸序列的参考资料,所以尚未 见到应用PCR技术检测DHV Ⅰ的研究报道。笔者在获得DHV Ⅰ的CHv-1 强毒株的 全基因序列的基础上,建立了检测DHV Ⅰ基因组的RT-PCR方法。”   事实上,在2006年9月21日“作者”将“文章一”投到《中国兽医科学》之 前,公共数据库中已经释放了韩国Kim等人测定的DHV-1 DRL-62株(DQ219396)和 R85952株(DQ226541)基因组序列,台湾Tseng等测定的03D株(NC_008250)、H株 (DQ249300)和5886株(DQ249301)的基因组序列,我课题组测定的C80株(DQ864514) 基因组中2C-3’末端序列以及E-63株基因组的3’末端序列(DQ864514) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。同时,在2006年9月长沙召开的中国畜牧兽 医学会禽病学分会上,我已报告了有关DHV-1基因组测序和基因组结构的研究进 展,作为中国畜牧兽医学会禽病学分会常务理事,程安春教授难道不知道吗?也 许“作者”会说,他们在2006年9月21日投稿时,未曾注意到公共数据库中的 DHV-1基因序列,但请注意,“文章一”的修回日期是2006年12月29日,此前, 即2006年10月18日,程安春教授和其他三位作者曾将登录号为EF064886的 Sichuan株的440 bp 3D序列提交到公共数据库,难道还见不到公共数据库中已提 交的DHV序列吗?据此提出问题3。   问题3:当公共数据库中在2006年7月中旬左右已释放DHV-1 DRL-62株、 R85952株、03D株、H株和5886株的全序列、C80株和E63株的部分序列的情况下, “作者”为何要在讨论部分说“目前尚无DHV Ⅰ基因组核苷酸序列的参考资料” 这句话?是否为了说明其工作的真实性和首创性,以获取《中国兽医科学》审稿 专家的信任?   值得进一步深究的是“所以尚未见到应用PCR技术检测DHV Ⅰ的研究报道” 这句话,果真如此吗?2006年7月18日,以我的学生刘艳萍为第一作者的一篇稿 子投《病毒学报》,该稿子描述的就是用引物(5′-ACAATGACCCAGCCTTAG-3′)和 (5′-CCACTGTATCTTCC CTTC-3′)建立一个检测鸭肝炎病毒440bp 3D基因的 RT-PCR方法,虽然那时刘艳萍的文章尚未发表正在评审,但我仍然要请问程安春 教授,是否为《病毒学报》评审过刘艳萍的稿子?是否见到过刘艳萍原稿中的引 物序列以及RT-PCR方法?同时,刘艳萍的稿子曾于2006年9月发表于中国畜牧兽 医学会禽病学分会论文集(601页,为保密,我们在文中隐去了引物序列),但是 该文描述的就是检测鸭肝炎病毒的440 bp 3D基因的RT-PCR方法的建立,作为中 国畜牧兽医学会禽病学分会常务理事,程安春教授难道没见过吗?   (二) 关于试验用鸭   “文章一”的材料和方法部分,“作者”写道:“1. 1. 2 实验动物为1日 龄樱桃谷鸭,经ELISA检测其血清中DVH Ⅰ抗体阴性,血清DHV Ⅰ的RT-PCR检测 结果为阴性。”   我的理解是,这些鸭子将用于人工感染强毒株CHv-1,通过用所建立的 RT-PCR方法对人工感染强毒株CHv-1后死亡鸭的组织进行检测,并通过与 Dot-ELISA和病毒分离的结果进行比较分析,来衡量所建立的RT-PCR的敏感性和 可靠性。显然,用这些鸭子所进行的人工感染试验是为建立RT-PCR方法做准备的。 据此提出问题4。   问题4:在“作者”建立起检测DHV Ⅰ的RT-PCR方法之前,用于确定1日龄樱 桃谷鸭的血清中DHV Ⅰ为阴性时所使用的RT-PCR方法是哪个?   “文章二”中,“作者”用了11日龄SPF鸭胚繁殖DHV-1强毒株CHv-1,用了 10只1日龄的SPF北京鸭(SPF Pekin duckling)进行DHV-1强毒株CHv-1的人工感染 试验,据此提出问题5。   问题5:用于繁殖CHv-1株的SPF鸭胚和用于人工感染CHv-1株的1日龄SPF北京 鸭购自何处?   (三) 关于电泳结果   在“文章一”的图3,1987-2005年采集并在-20℃保存的19份DHV-1感染鸭肝 的电泳条带几乎一样粗;在文章二的Fig.1,1986-2006年分离的19株分离株的电 泳条带也是几乎一样粗。这样的试验结果不禁令人想到下述问题:   问题6:“文章一”的图3中,所谓“19个鸭肝样品”是否为同一个样?文章 二的Fig.1中,所谓“19个分离株”是否也是同一个样?   (四) 关于19株分离株440-bp 3D基因是否存在变异性   在“文章二”的结果部分和讨论部分,“作者”描述,用所建立的RT-PCR成 功的对19株分离株进行了检测。这些分离株来自我国11个省(市、自治区),分离 时间跨越21年(1986-2006年,见文章中表1)。“作者”说 “Sequencing of these RT-PCR fragments showed no genetic variation over different districts of China (data not shown)”.   然而,我们的研究表明(Wang, L., Pan, M., Fu, Y. and Zhang, D. 2008, Virus Genes 37, 52–59),在DHV基因组的该440 bp 3D区,不同基因型间存在 18–22%的核苷酸序列差异,血清1型(即基因A型)内不同毒株间存在0–9%的核苷 酸序列差异。我们的研究中所用的序列除了我们自己测定的以外,还包括文章写 作之前GenBank中所有DHV全序列中的440 bp 3D部分。除了个别毒株之间440 bp 3D序列完全相同外,大多存在或多或少的序列差异。   由于“作者”未在“文章二”中显示所测序列结果,也未将所测序列提交到 公共数据库,因此,我不清楚“作者”所说的“no genetic variation”是否表 示19株分离株的扩增产物序列完全相同,如果是,提出问题7:   问题7:在21年分离自我国11个不同的省(市、自治区)的19株DHV为何其440 bp 3D序列完全相同?这种序列完全相同的可能性有多大?如果不可能,是否意 味着“作者”并未测定那19个分离株的序列,所谓“no genetic variation”的 结果是拍拍脑袋想出来的?   (五) 关于连续21年或22年的人工感染试验   “文章二”中,“作者”设计了一个试验(2.7.ii),用三种方法检测在-20℃ 保存的22份人工感染鸭的肝脏样品。然而,在材料和方法的2.7(ii)部分可见, 这22份病料是从21年间(1986-2006年)每年用CHv-1株进行人工感染试验后留取的 (“作者”标注:每年留一份),若每年留一份,只可能有21份样品,多出的一份 是哪儿来的?当然,“作者”在结果部分(表2)又说样品是1986-2007年留的。显 然,两个时间段总有一个是错的!因两个时间段都是“作者”自己写的,如何认 定结果部分所述的1986-2007年就是真实的,而材料和方法中所述的1986-2006年 就是书写错误?   即使留样时间段是1986-2007年,在22年间,每年都用同一株强毒(CHv-1)进 行人工感染试验,这种试验设计的合理性何在?这种试验的必要性有多大?尽管 “作者”在“文章二”的表1注明强毒株CHv-1是1985年分离的,但查阅上世纪90 年代程安春教授发表的多篇文章,并未见程安春教授用过该强毒株!网上检索程 安春教授的简历可知,程安春教授于1985年7月本科毕业于西南民族大学,1990 年7月硕士毕业于四川农业大学,1990年10月-2000年2月在美国Iowa州立大学兽 医学院作访问学者,1995年10月晋升为副教授。据此提出问题8:   问题8:程安春教授等从1986年至2007年每年用强毒株CHv-1进行雏鸭的人工 感染试验并留取病料的可能性有多大?   (六) 关于ELISA   “文章二”中,“作者”对10只人工感染致死的SPF北京鸭肝脏进行了3种方 法的比较检测,其中ELISA引用了文献(Zhao et al., 1991)(见2.7 i),表明 “作者”采用了Zhao et al.(1991)描述的ELISA检测了样品中的DHV-1。   在对21年或22年间留取的22份人工感染CHv-1株的鸭肝脏和185份临床样品的 比较检测中,ELISA检测部分未引用文献 (见2.7 ii和iii),但根据上下文以及 文后的参考文献,我们亦可认为“作者”采用了Zhao et al.(1991)描述的ELISA。   然而,Zhao et al.(1991)所描述的ELISA是一个间接ELISA,它是用已知的 DHV抗原进行包被来检测鸭血清中的DHV抗体的。据此提出问题9:   问题9. “作者”是如何用Zhao et al(1991)描述的间接ELISA来确定3个试 验中共计217份肝脏样品是否存在DHV-1的?   (七) 关于“病毒分离法”   无论是“文章一”还是“文章二”,“作者”均采取“病毒分离(virus isolation)”这一方法对人工感染样品和临床样品进行了检测,以与RT-PCR和 ELISA的检测结果相比较。但是,“作者”既没有交代病毒分离时所用的实验宿 主,也没有描述分离到病毒时是根据何种指标将病毒鉴定为DHV特别是DHV-1的? 据此提出问题10:   问题10. 分离病毒时,“作者”使用了何种实验宿主?用什么指标将结果判 断为病毒分离阳性或阴性?如何仅根据“病毒分离”这个方法将分离物鉴定为 DHV的血清1型(DHV-1)?   在“文章一”中,“作者”尚且将48份临床样品描述为来自临床症状和病理 变化与鸭肝炎相符的发病鸭,对于这样的病料,按照现有的知识,若分离到病毒 时,我们通常可以将其判断为DHV,但若据此将分离物鉴定为血清1型(DHV-1)则 是令人匪夷所思的。近年来,我国许多地区除了流行DHV的血清1型,还在流行 DHV的新型(见随后的描述),而仅依据病毒分离时鸡胚或鸭胚或细胞培养的病变 是不能鉴定出血清型的。虽然“作者”在48份临床样品检测部分没有明确指出病 毒分离阳性率是指分离到血清1型DHV,但依据整个文章的上下文,我们可以认为, “文章一”所谓的“56.25%的病毒分离检出率”指的是从56.25%的样品中分离到 血清1型DHV。否则,如何对能够检出不同血清型DHV的“病毒分离法”与极易或 只可能(后述)检出血清1型DHV的“RT-PCR法”进行检出率或敏感性的比较?因 此,我认为,这个56.25%的病毒分离率是一个有问题的数据。   在“文章二”中,“作者”将185份临床样品描述为“clinically suspected diseased liver samples of ducklings”,这是一个模棱两可的描 述。对于这种病料,不知道“作者”如何能认定分离到的病毒就是DHV,而且还 是DHV的血清1型?如果“作者”仅依靠“virus isolation”这个方法就将103份 样品中的分离物鉴定为DHV-1,我亦怀疑“文章二”表3中的55.7%的病毒分离阳 性率是一个伪造的数据。   对于两篇文章中对临床样品检测的结果,随后我将进行更为详尽的分析。   (八) 关于DHV的有关情况和两篇文章中所描述的引物   1. DHV的血清型   虽然以往将鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus, DHV)区分为3个型,但其中 的血清2型和3型属于两种不同的星状病毒(Http://www.picornaviridae.com)。 将传统的血清2型和3型排除后,近两年的研究表明,DHV是小RNA病毒科中一个新 属的成员,可区分为血清1型(DHV-1)、台湾新型和韩国新型 (Ding and Zhang, 2007, Virology, 361, 9–17; Tseng et al., 2007, Virus research, 123, 190–203; Kim et al., 2006, Journal of General Virology, 87, 3307–3316; Tseng and Tsai, 2007, virus research, 126, 19–23; Kim et al., 2007, Arch. Virol., 152, 2059–2072)。台湾新型和韩国新型之间的血清学关系尚未 进行比较,但它们均与DHV-1之间没有交叉中和反应。在基因组的各个基因区(除 3’UTR),台湾新型、韩国新型和DHV-1三类病毒之间均存在较大的核苷酸序列差 异,据此可推测,台湾新型和韩国新型可能是两个独立的血清型。   2. DHV的基因型   基于VP1, VP0, VP3, 440-bp 3D核苷酸序列(Wang et al., 2008, Virus Genes, 37, 52–59)以及5’UTR的部分序列(Fu et al., Vet Microbiol. 2008. 131, 247–257),DHV可分为3个基因型,我们将它们命名为基因A型、B型和C型, 分别对应于DHV血清1型(DHV-1)、台湾新型和韩国新型。   3. 我国DHV的血清型(基因型)流行现状   我们的研究表明,近年来我国一些养鸭地区同时流行血清1型(或基因A型)和 韩国样新型(或基因C型) (Fu et al., Vet Microbiol. 2008. 131, 247–257)。 国内苏敬良等(中国兽医科技,2002, 32, 15–16)和霍翠梅等(浙江农业科学, 2007, 3, 343–345)曾分别用血清学方法鉴定出新型DHV的存在。我们实验室于 2007年12月19日向GenBank提交了基因C型毒株C-GY的基因组序列(Pan,M., Fu,Y., Wang,X., Xu,Y. and Zhang,D.登录号EU352805;潘梦等,国内新型鸭肝炎病毒基 因组3’末端的序列特点. 中国农业大学学报, 2008, 13(3), 65-70),其他学者 也测定了几个新型毒株的基因组序列,如B63株(GenBank登录号EU747874,中国 农大Wu, P.F., Zhang, G.Z., Su, J.L. and Han, B.提交)、G株(GenBank登录 号EU755009,福建农科院Shi, S., Chen, Z., Yang, W. and Huang, Y.提交)和 FS株(GenBank登录号EU877916,华南农大He, R.Y., Zhang, G.H., Luo, Y.J., Sun, W. and He, Y.M.提交),进一步证实韩国样新型即基因C型DHV在我国的存 在。   4. 关于扩增440-bp 3D序列的引物   用引物(5’-ACAATGACCCAGCCTTAG和5’-CCACTGTATCTTCCCTTC)极易从不同的 DHV-1毒株中扩增出440-bp的3D序列(详见我指导的中国农业大学2004届硕士生丁 春宇的硕士学位论文),但用该引物不能从基因C型毒株C-GY中扩增出440-bp 3D 序列(潘梦等,已被《中国兽医杂志》接受的稿件)。   序列比较结果显示,引物(5’-ACAATGACCCAGCCTTAG和5’ -CCACTGTATCTTCCCTTC)扩增C-GY的结果为阴性可能源于上游引物序列与C-GY的引 物结合区存在5个碱基的差异。   由于中国大陆尚未分离到台湾新型(即基因B型)DHV,因此,我不清楚用引物 (5’-ACAATGACCCAGCCTTAG和5’-CCACTGTATCTTCCCTTC)是否可从基因B型DHV中扩 增出440-bp 3D序列。序列比较结果显示,其难度可能较大,因为上游引物序列 与基因B型毒株90D和04G的引物结合区也存在5个碱基的差异。   按照现有知识,如果用引物(5’-ACAATGACCCAGCCTTAG和5’-CCACTGTATCTTC CCTTC)从DHV分离株或临床样品中扩增到440-bp的3D序列,我们可以认为,该分 离株或临床样品含有血清1型DHV。也就是说,扩增该440-bp 3D序列的RT-PCR似 乎具有DHV血清1型特异性。当然,我还不清楚该RT-PCR是否一定就不能从所有其 他基因C型毒株中扩增出440-bp的3D序列,例如上游引物与基因C型毒株B63的引 物结合区只有3个碱基的差异。我的观点是,无论是建立DHV种特异性RT-PCR方法, 还是建立血清型(或基因型)特异性RT-PCR,引物FP和RP均不是最佳选择。   有个背景需简介:2005年9月我指导的硕士生丁春宇开始测定DHV-1 C80全序 列时,公共数据库中尚没有DHV的序列释放,经过前期的研究,我们从DHV-1 C80 株扩增出一条1246-bp的序列,为验证该序列是DHV的特异序列,我们设计了引物 (5’-ACAATGACCCAGCCTTAG和5’-CCACTGTATCTTCCCTTC),旨在通过扩增我们实验 室保存的其他DHV毒株来验证该1246-bp序列确实是DHV C80的(见中国农业大学 2004届硕士生丁春宇的硕士学位论文)。因该引物能有效的从我实验室保存的几 株DHV毒株和鸭肝样品中扩增出440 bp 3D序列,故中国农业大学2006届本科生刘 艳萍在我实验室做毕业实习时,我安排她利用该引物建立了检测鸭肝炎病毒的 RT-PCR方法,该文曾投《病毒学报》,但被拒(后述)。   目前,我们只能认为:如果从DHV分离株或临床样品中扩增到440-bp的3D序 列,则该分离株或临床样品一定含有血清1型DHV(DHV-1),否则,“文章一”用 RT-PCR检测48份临床样品时获得的91.7%的阳性率以及“文章二”用RT-PCR检测 185份临床样品时获得的89.2%的阳性率都是错误的。这是因为,从“文章一”和 “文章二”的题目即可看出,“作者”描述的是检测DHV-1的RT-PCR的建立(和应 用)。   (九) 关于“文章一”中RT-PCR法和病毒分离法的结果比较   “文章一”检测了48份临床肝脏样品,4份为RT-PCR阴性、44份为RT-PCR阳 性;21份为病毒分离阴性、27份为病毒分离阳性;根据“作者”在讨论和小结部 分对检测结果的进一步描述,可以看出,4份RT-PCR结果为阴性的病料同时也分 离不到病毒,而另外17份分离不到病毒的样品RT-PCR结果均为阳性,对于后者, “作者”的解释是“PCR检测阳性而病毒分离(和Dot-ELISA)检测阴性,这可能与 样品保存时间过长无完整病毒颗粒而仅存核酸或方法的灵敏度稍低不能检出微量 病毒有关”。   我认为,这种解释是没有道理的。可从以下几个方面进行剖析。   (1) 根据“作者”在材料和方法中的介绍,发病鸭临床症状和病理变化与鸭 肝炎相符。对于取自有典型鸭病毒性肝炎发病症状和病理变化的肝脏病料,应当 均含有DHV,我相信“作者”也会同意这一点。   (2) 按“作者”对历年保存的经病毒分离确诊为鸭肝炎的19份临床送检样品 的检测结果,可知:含DHV Ⅰ的肝组织在-20℃保存18年后还可用RT-PCR检出病 毒,至第10年可用Dot-ELISA检出,第6年可分离到DHV Ⅰ。而48份临床样品取自 2000~2005年(尽管“作者”在材料和方法部分称病料采集时间为1987-2005年, 但在结果部分和讨论小结部分,“作者”均称病料采集时间为2000~2005年,故 我认为病料采集时间应为2000~2005年),只有1-6年的保存期,若病料存放在 -20℃,只要病料中含有鸭肝炎病毒,病毒应当是存活的。   (3) 众所周知,DHV-1是极易分离到的病毒。但是,“文章一”的48份病料 中,共有21份病料分离不到病毒!按照上述介绍,可认为,PCR检测结果呈阳性 的44份病料肯定含有血清1型DHV。然而,“作者”从其中的17份病料中未能分离 到DHV-1。这是有问题的!   (4) “作者”建立的RT-PCR的敏感性为30 pg,用如此敏感的方法去检测足 以引起鸭发病和死亡的DHV,却还有4份病料扩增不出目的条带,但“作者”对此 未作解释。   如果“作者”所用的48份样品是真实的,由于它们来自临床症状和病理变化 与鸭肝炎相符的发病鸭,必定均含有鸭肝炎病毒。我的观点是,如果这些样品均 来自感染DHV-1的鸭群,应当都能扩增出440-bp的3D序列!如果扩增不出,例如 “文章一”的这4份PCR阴性的病料,应当含有新型DHV!可能性最大的是含有基 因C型DHV。否则,发病鸭不可能表现出与鸭肝炎相符的临床症状和病理变化!之 所以4份病料的PCR检测结果会呈阴性,我认为并非源于该方法的敏感性高低,而 是“作者”所用的引物与新型DHV基因组中引物结合区存在序列差异。   是否很难或者不可能分离到新型DHV?回答是否定的。因为台湾学者已分离 到基因B型毒株90D和04G(Tseng and Tsai, 2007, virus research, 126, 19– 23),韩国学者已分离到基因C型毒株AP-03337, AP-04009, AP-04114 和 AP-04203 (Kim et al., 2007, Arch. Virol., 152, 2059–2072), 我们实验室 也很容易的分离到基因C型毒株C-GY, C-YDF, C-BLZ和C-YCW (Fu et al., Vet Microbiol. 2008. 131, 247–257), 国内其他研究者也已分离到基因C型毒株 B63株、G株和FS株。   综述所述,我的观点是,对于48份来自临床症状和病理变化与鸭肝炎相符的 发病鸭的病变肝脏,44份病料PCR检测呈阳性是可能的,但其中有17份病料分离 不到DHV-1的结果是有问题的!4份病料PCR检测呈阴性的结果是可能的,但分离 不到病毒的结果是有问题的。据此提出问题11。   问题11:1~6年内,取自临床症状和病理变化与鸭肝炎相符的发病鸭的48份 临床肝脏样品中,有4份的RT-PCR结果和病毒分离结果均为阴性,其原因何在? 是否意味着在不存在病毒感染的情况下,鸭子也能发生鸭病毒性肝炎?在RT-PCR 检测为阳性的44份样品中,已确定含有DHV-1,为何还有17份为病毒分离阴性? 样品仅仅保存1~6年,如何就没有完整病毒颗粒而仅存核酸?仅存的核酸(RNA)是 如何从病毒颗粒中溢出的?溢出后是否会降解?取自临床症状和病理变化与鸭肝 炎相符的发病鸭的临床样品中,病毒含量如何仅是“微量”?极易检出血清1型 的该RT-PCR方法和能检测不同血清型DHV的病毒分离法是否能如此做敏感性的比 较?Dot-ELISA中,不同血清型DHV是否存在交叉反应?如何认定检出的病毒就一 定是血清1型DHV? “作者”是否在人为的编造“新建立的RT-PCR的敏感性一定要 高于已有的Dot-ELISA和病毒分离法的敏感性”这一结论?   (十) 关于“文章二”中RT-PCR和病毒分离的结果比较   “文章二”检测了185份临床肝脏样品,20份为RT-PCR阴性、165份为RT-PCR 阳性;82份为病毒分离阴性、103份为病毒分离阳性。作者没有象“文章一”那 样对“文章二”的检测结果进一步详细的描述。但是,我们通过对“文章二”中 表3的分析,可将结果分为2个组。   组1含120份肝样品,RT-PCR结果均为阳性,“virus isolation”阳性率为 65.8% (79/120)。   组2含65肝样品,RT-PCR阳性率为69.2% (45/65) “virus isolation”阳性 率为41.5% (27/65)。   1. 对组1结果的分析:   通常情况下,如果从肝脏样品中扩增出440-bp的3D序列,可认为样品中存在 DHV-1。然而,在RT-PCR检测为阳性的120份样品中,还有41份未能分离到DHV-1。 “作者”由此得出了RT-PCR的敏感性高于病毒分离的结论。但我认为,病毒分离 的阳性率太低。根据《禽病学》和OIE的诊断手册的介绍以及我们平时的研究工 作可知,将病变肝脏匀浆接种鸡胚或鸭胚极易分离到DHV-1。特别是,临床样品 取自2006-2008年,均属新鲜的病料。最新鲜的3份病料是2008年1月12日来自四 川省的鸭场1,离“作者”将“文章二”投自Journal of Microbiological Methods仅相隔约1月时间,然而,3份病料中仍有1份未能分离到病毒。而值得注 意的是,“作者”将含毒肝脏在-20℃保存11年后仍能分离到DHV-1。因此,我认 为,65.8%的病毒分离阳性率是一个有问题的结果。   我不清楚“作者”将185份样品描述为“clinically suspected diseased liver samples of ducklings”的真正含义是什么。但是,无论怎样,这185份 样品的采集无非有两个可能。第一种可能是,它们是随机采集的病(死)鸭肝脏, 如果是这样,样品中可能含有鸭肝炎病毒、禽流感病毒、鸭瘟病毒等。据此提出 问题12。   问题12:当“作者”收集185份临床样品时,是否根据鸭病毒性肝炎的特点 进行过初步的临床诊断?“clinically suspected diseased liver samples of ducklings”是何意?发病鸭或死亡鸭是否表现典型的鸭病毒性肝炎的临床症状 和/或肝脏出血病变?如果病料是随机收的,即“作者”不知道鸭子是否表现鸭 病毒性肝炎的临床表现和病理变化,“作者”是如何仅依据“virus isolation” 这一方法将120份RT-PCR阳性样品中的79份以及总185份样品中的103份中的分离 物鉴定为DHV特别是DHV-1的?   第二种可能是,“作者”在采集这185份临床样品时,先依据病鸭或死亡鸭 的临床症状和/或典型的肝脏出血病变进行初步诊断。若是如此,我们进一步分 析组2的数据。   2. 对组2结果的分析   虽然“作者”未对结果进行详细的介绍,但我们仍能看出,RT-PCR结果为阳 性的45份样品中,仍有部分样品分离不到DHV-1。如前所述,其结果是有问题的。   对于20份RT-PCR结果为阴性的样品而言,不知道“作者”如何解释这一结果? 也许“作者”会认为RT-PCR结果的阳性率不应当是100%?如前所述,如果组2中 的65份肝脏样品果真是从感染DHV-1的鸭群采集的,病(死)鸭的肝脏中必定含有 足够量的病毒可供RT-PCR检出。请注意,“文章二”描述的RT-PCR的检测下限为 3 pg/10 μl。当然,由于我国近年来流行新的血清型例如韩国样新型(即基因C 型),对于部分临床样品为RT-PCR阴性,我是可以理解的,但我并不认为这与方 法的敏感性高低有关,而是源于所用引物与新型DHV引物结合区的序列差异所致。 也就是说,在RT-PCR检测结果为阴性的20份肝脏样品中,可能含有新型DHV,最 大的可能是含有韩国样新型(即基因C型)。   由于“作者”未对检测结果进行详细介绍,尚不清楚从RT-PCR阴性的20份样 品中分离病毒的结果如何,但无非有3种可能性。   (A) 从这20份样品中均分离不到病毒   如果出现这一结果,那是有问题的。前已述,在RT-PCR检测结果为阴性的20 份肝脏样品中,可能含有新型DHV。其中韩国样新型的可能性最大。是否很难或 不可能分离到新型DHV?回答是否定的。见前述。   也许“作者”会说,即使分离到新型DHV,因为它们不是血清1型,也只能将 结果记录为病毒分离阴性。但是,仅依据“virus isolation”就可鉴定出血清 型吗?   (B) 从这20份样品中均可分离到病毒   如果从RT-PCR检测结果为阴性的20份肝脏样品分离到病毒,我认为是正确的。 但是,若将它们记录为病毒分离结果为阳性,我认为是错误的。因为“作者”所 说的病毒分离阳性指的是分离到血清1型DHV。对于该RT-PCR检测呈阴性的样品, 若从中分离到病毒必定不是DHV-1,而可能是某种新型DHV。因此,如果出现这一 结果,也是有问题的。   (C) 20份样品中,部分可分离到病毒,部分分离不到病毒   这是(A)和(B)的组合。   综上所述,我认为,对于185份被描述为“clinically suspected diseased liver samples of ducklings”肝脏样品,如果“作者”是随机收的,89.2%的 RT-PCR阳性率是过高的,而55.7%的病毒分离率则是虚假的。如果“作者”对发 病或死亡鸭进行了初步的诊断,有目的收集具有典型的肝脏出血点的病料,则 89.2%的RT-PCR阳性率是可能的,但55.7%的病毒分离率是有问题的。对于PCR检 测呈阴性的20份病料,无论病毒分离的结果如何,如上所述,都是有问题的。据 此提出问题13和14。   问题13:如果发病鸭或死亡鸭表现典型的鸭病毒性肝炎的临床症状和/或肝 脏出血病变,在1月~3年内收集的185份病料中,为何有82份分离不到病毒?在 120份经RT-PCR检测为阳性即肯定存在DHV-1的样品中,为何还有41份分离不到 DHV-1?   问题14:如果发病鸭或死亡鸭表现典型的鸭病毒性肝炎的临床症状和/或肝 脏出血病变,为何有20份样品经RT-PCR检测为阴性?RT-PCR检测为阴性的20份样 品中,有几份分离不到病毒?是否意味着在不存在病毒感染的情况下,鸭子也能 发生鸭病毒性肝炎?有几份能分离到病毒?分离到的是什么病毒?为什么在 RT-PCR检测为阴性的样品中也能分离到病毒?如何据此得出“RT-PCR的敏感性高 于病毒分离”这一结论?   此外,在“文章一”和“文章二”中,“作者”均对保存的含毒肝脏样品用 三种方法进行了比较检测。“文章一”的含毒肝脏保存了18年(1987年11月至 2005年11月),保存18年后还可用RT-PCR检出病毒,至第10年可用Dot-ELISA检出, 第6年可分离到DHV Ⅰ。“文章二”的含毒肝脏保存了21年(1986年至2006)或22 年(1986年至2007),保存22年后可用RT-PCR检出病毒,而ELISA和病毒分离只能 检测保存13年和11年的DHV-1。据此提出问题15。   问题15:两篇文章中,Dot-ELISA/ELISA和病毒分离的检出年限存在3年和5 年的差异,这是为什么?   最后,结合“文章一”、“文章二”和“文章三”,我们可以看出,在“文 章一”,“作者”宣称CHv-1的全序列已完成测序(前言部分),该毒株的440 bp 3D扩增产物也已测序(结果部分);在“文章二”,“作者”宣称测定了19株分离 株的440 bp 3D序列;在“文章三”,“作者”宣称测定了XC株的440 bp 3D扩增 产物序列。然而,无论在哪篇文章,都见不到序列比对图,“作者”也没有将这 些序列提交到公共数据库。另一方面,“作者”在“文章二”和“文章三”中均 使用了我课题组所测定的三条序列(DQ864514, DQ864515, 和EU106104)作为 RT-PCR建立的依据以及荧光PCR引物设计的参考。在“文章三”中,“作者”宣 称,建立荧光PCR时所使用的引物(P3和P4)及探针(FP)是基于上述3条序列中的 440 bp 3D序列和他们所测定的440 bp 3D序列(EF064886)的最保守区设计的,事 实上,这4条440 bp 3D序列完全相同。据此提出问题16和问题17。   问题16:“作者”所宣称已测定的那些序列是否是真实的?   问题17:如何从4条完全相同的440 bp 3D序列中选择最保守区设计荧光PCR 引物和探针?   六、是否涉嫌剽窃的问题   2006年春季,中国农业大学应届本科毕业生刘艳萍在我实验室进行毕业实习, 她在我指导的2004届硕士生丁春宇的研究基础上做了一些试验。随后,刘艳萍写 了一篇文章,题为“检测鸭肝炎病毒的种特异性RT-PCR的建立”,在2006年7月 18日投《病毒学报》(稿号60108,作者:刘艳萍,丁春宇,张大丙,通讯作者: 张大丙),经过约3个月的评审期,文章被拒。   2006年9月21日,“文章一”被程安春教授等人投到《中国兽医科学》并于 2007年发表。   比较刘艳萍投到《病毒学报》的手稿和“文章一”,可发现刘艳萍手稿与 “文章一”存在相同和极相似的内容。   (一) 建立RT-PCR所用的引物序列完全相同;扩增的靶基因均为鸭肝炎病毒 3D基因的440 bp。   (1) “刘艳萍稿件”中的引物设计部分 根据本实验室前期测定的DHV C80株 序列(DQ864514),用Primer premier 5.0软件设计引物。上游引物F440:5’ ACAATGACCCAGCCTTAG 3’,下游引物R440:5’CCACTGTATCTTCCCTTC 3’,引物 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。   (2) “文章一”的引物设计部分 根据DHV Ⅰ的CHV-1 强毒株3D蛋白基因序 列,用Primer Premier 5. 0 软件设计了如下引物:上游引物FP:5′ -ACAATGACCCAGCCTTAG-3′,下游引物RP:5′-CCACTGTATCTTCCCTTC-3′。引物 由大连宝生物工程有限公司合成。   靶基因的选择、引物的设计和病毒基因组核酸提取无疑是建立RT-PCR方法的 关键步骤。对于分子生物学研究开展相对较晚的鸭肝炎病毒而言,引物序列无疑 是建立RT-PCR检测方法的核心!特别是在2006年7月之前,国内外见不到一条DHV 的基因序列,虽然台湾学者和韩国学者那时测定了几株DHV的基因组序列并提交 到GenBank,但没有释放,此时,引物序列对于建立鸭肝炎病毒的RT-PCR检测方 法的重要性是不言而喻的!   (二) 病毒核酸提取部分,所用试剂、试剂的剂量、甚至文字描述风格也极 为相似。   (1) 刘艳萍稿件中的核酸提取部分 含毒尿囊液经10000 r/min离心5 min后 取上清。病变肝组织0.3 g,按1:5用生理盐水研磨,冻融3次,8000 r/min 离心 10 min,取上清。将上清液50 μl置于eppendorf管,依次加入200 μl变性裂解 液、5 μl二硫苏糖醇 (1 mM)、线性聚丙烯酰胺 (20 μg/管),颠倒混匀后室温 静置10 min;加入2倍体积且预冷的无水乙醇,混匀后-20℃静置5 min;12000 r/min 离心8 min,弃上清液,用70%的乙醇洗涤沉淀,12000 r/min 离心2 min, 弃上清液,将干燥后的沉淀物溶解在30 μl无RNase酶污染的水中。按同样方法 从正常鸡胚尿囊液和健康鸭的肝脏中提取核酸作为对照。   在“刘艳萍稿件”的RT-PCR部分还提到“以Ⅰ型DHV C80株为阳性组,以鸭 瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鹅副粘病毒、鹅呼肠孤病毒、正常鸡胚尿 囊液和健康鸭肝组织为阴性组,进行RT-PCR。”   (2) “文章一”的病毒核酸的抽提部分 含DHV Ⅰ强毒CHV-1 株的鸭胚尿囊 液经8 000 r/ min 离心10 min后取上清;取病变肝组织0. 5 g,按1∶10体积比 用生理盐水研磨,冻融3次,10 000 r/ min 离心15min,取上清液。将上清液50 μL 置于EP管中,依次加入200 μL变性裂解液、5 μL二硫苏糖醇(1mmol/L)、 线性聚丙烯酰胺(20 μg/管),颠倒混匀后室温静置10 min;加入2倍体积预冷无 水乙醇,混匀后-15℃静置10 min;13 000 r/ min离心10 min,弃上清液,用 700 mL/L的乙醇洗涤沉淀,13 000 r/ min离心3 min,弃上清液,将干燥后的沉 淀物溶解在30 μL无RNA酶污染的水中。相同方法提取正常鸭胚尿囊液、健康鸭 肝、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒、雏鹅新型病毒性肠炎病毒、禽流感 病毒( H5N2 亚型)、鸭病毒性肿头出血症病毒中的核酸作为对照或特异性检验。   如果两篇文章没有彼此剽窃,双方同时从长度为1359 nt的3D基因中选择743 -1182碱基位作为靶基因,并设计相同序列的引物进行扩增,用相同的方法提取 病毒基因组核酸,并用几乎相同的语言描述病毒核酸的提取过程,这种巧合的概 率到底有多大?如果不是巧合而是剽窃所致,到底是刘艳萍的被拒稿剽窃了“文 章一”,还是“文章一”剽窃了刘艳萍的被拒稿?   我保证,程安春等人的“文章一”在2007年公开发表之前,我们从未见过。 而程安春教授是否能保证在2006年7月18日(刘艳萍稿件投《病毒学报》)-2006 年9月21日(“文章一”投稿日)之间从未见过刘艳萍的稿件?作为《病毒学报》 的编委,程安春教授是否评审过刘艳萍的稿子?是否借审稿之际不道德的将刘艳 萍稿件中的内容据为己有?   如果“文章一”和“文章二”中所用的引物是“作者”原创的,我提出如下 问题:   (1) “文章一”和“文章二”中,“作者”描述了一个完全相同的RT-PCR方 法。在“文章一”,“作者”宣称引物FP(5′-ACAATGACCCAGCCTTAG-3′)和RP(5′ -CCACTGTATCTTCC CTTC-3′)是基于全序列已测定的CHv-1株的3D基因序列设计的。 “文章二”中,“作者”又宣称引物FP(5’-acaatgacccagccttag-3’)和RP(5’ -ccactgtatcttcccttc-3’)是基于登录号为EF064886的440 bp 3D序列设计的。 这是为什么?   (2) 从“作者”宣称已测定了CHv-1的全序列至今,两年过去了,“作者” 将与CHv-1株全序列有关的文章“另文报道”在哪个刊物?   (3) “文章二”中,登录号为EF064886的序列就是分离株Sichuan株的440bp 3D序列,由于引物FP和RP的序列位于该440 bp 3D序列的两端,因此,该440 bp 3D序列颇似引物FP和RP的扩增产物序列。如果该440bp 3D序列就是引物FP和RP的 扩增产物序列,如何根据一对引物的扩增产物序列设计这对引物?如果该440bp 3D序列不是引物FP和RP的扩增产物序列,那么,该440bp 3D序列是用什么手段得 到的?是否是“作者”从我们提交到GenBank中的C80株或E63株序列中截取下来 的?   (4) 2008年1月21日, “文章二”8个“作者”中的4个有一篇稿子投 Journal of Virological Methods,现已发表,称为“文章三”:Miao Yang, Anchun Cheng, Mingshu Wang, Hongyi Xing.2008. Development and application of a one-step real-time Taqman RT-PCR assay for detection of Duck hepatitis virus type1. Journal of Virological Methods, 153, 55 –60。   在“文章三”的2.2.1部分,“作者”写道:“According to the sequence of DHV-1 isolate Sichuan obtained by the Avian Disease Research Center of Sichuan Agricultural University (GenBank accession no. EF064886), a conventional RT-PCR was carried out using a template from DHV-1 XC Strain, with primers P1 and P2 (generated by TakaRa, Japan) targeting the conserved region in the 3D gene (Cheng et al., 2007). The product size was 440 bp” 。注:参考文献(Cheng et al., 2007)即是“文章一”   这段描述令人费解。“作者”并没有说明引物P1和P2是根据哪条参考序列设 计的,却说该引物对是以“文章一”中3D基因的保守区为靶向;同时,一个传统 RT-PCR试验的完成是根据DHV-1 Sichuan株的序列(登录号为EF064886),事实上 该序列也就是前述的440 bp 3D序列。   虽然“作者”在该文中未列出引物序列,但根据该段落的信息(引物P1和P2 的扩增产物是DHV-1的440 bp 3D序列)和结果部分的一个信息(用该引物从DHV-1 XC株所扩增的440 bp 3D序列与登录号为EF064886的440 bp 3D序列完全相同), 我们也可以判断出,引物P1和P2必定位于440 bp 3D序列的两端。由于引物P1和 P2与“文章一”和“文章二”所用的引物FP和RP扩增的是DHV-1基因组中相同的 440 bp 3D序列,特别是“文章二”中“作者”同样是根据DHV-1 Sichuan株的 440 bp的3D序列(EF064886)设计了引物FP和RP,是否P1和P2就是FP和RP?   由于“文章三”的引物(P1和P2)和“文章一”的引物(FP和RP)扩增的是相同 的440 bp 3D序列,且“文章三”在上述段落中又引用了“文章一”作为参考文 献,故必须提出几个问题:   (i) 为何“作者”在“文章三”中不直接使用“文章一”中的引物(FP和RP), 却额外使用一对不给序列的引物( P1和P2)?   (ii) “文章一”的前言中,“作者”只宣称CHv-1株的基因组序列已测定, “文章一”的结果部分,“作者”也只宣称测定了CHv-1株的440 bp 3D扩增产物 序列(当然,CHv-1的全基因组序列和该毒株的440 bp 3D序列我们是看不到的), 而且整篇文章中没有使用任何其他毒株的3D序列进行分析比较(前已述,“作者” 认为那时没有DHV-1基因组核苷酸序列的参考资料),那么,在只有一个毒株 (CHv-1)的3D序列的情况下,“文章三”中的引物(P1和P2)是如何靶向该3D序列 的保守区的?   (iii)上述段落中所描述的“根据DHV-1 Sichuan株的440 bp的3D序列,一个 传统的RT-PCR试验被完成”是什么意思?是否指根据该序列设计了引物P1和P2? 若是如此,为什么引物P1和P2还要靶向“文章一”CHv-1株的3D序列的保守区? 既有全序列已测的CHv-1的3D序列,为何还要根据DHV-1 Sichuan株的440 bp的3D 序列这样一个疑似为P1和P2靶基因的序列设计引物P1和P2?   我还想说的是,如最终证实“文章一”的“作者”涉嫌剽窃,那就意味着, 四川农业大学博士生导师程安春教授极其恶劣地利用审稿机会将中国农业大学本 科生刘艳萍的手稿中的内容据为己有!在补充一些涉嫌为伪造的数据后,极不光 彩地重复发表于《中国兽医科学》和《Journal of Microbiological Methods》, 在这一过程中,博导、教授、研究生等共18人次参与!也意味着,在不到两个月 时间内,即2006年7月18日(刘艳萍稿件投《病毒学报》日)-2006年9月21日 (“文章一”投稿日)之间,“文章一”的“作者”对18只人工感染死亡鸭的心、 肝、脾、肺、脑,10只对照鸭的心、肝、脾、肺、脑,19份历年保存的样品,以 及48份临床病料共计207份样品进行了RT-PCR检测、Dot-ELISA检测和病毒分离! 按“文章一”介绍的病毒分离阳性结果计算,“作者”应共分离到病毒104株, 同时,“作者”还依据“病毒分离”这一方法将分离到的104株病毒鉴定为DHV的 血清1型,这是否可能?如果不可能,将进一步证实“文章一”存在学术造假行 为!   中国农业大学动物医学院 张大丙   2008年10月9日 (XYS20081012) ◇◇新语丝(www.xys.org)(xys2.dxiong.com)(www.xysforum.org)(xys-reader.org)◇◇